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GB/T 19495 consists of the following parts, under the general title of Detection of genetically modified organisms and derived products:
——GB/T 19495.1 Detection of genetically modified organisms and derived products—General requirements and definitions;
——GB/T 19495.2 Detection of genetically modified organisms and derived products—General requirements for laboratories;
——GB/T 19495.3 Detection of genetically modified organisms and derived products—Nucleic acid extraction;
——GB/T 19495.4 Detection of genetically modified organisms and derived products—Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods;
——GB/T 19495.5 Detection of genetically modified organisms and derived products—Quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods;
——GB/T 19495.6 Detection of genetically modified organisms and derived products—Gene-chip detection;
——GB/T 19495.7 Detection of genetically modified organisms and derived products—Methods for sampling and sample preparation;
——GB/T 19495.8 Detection of genetically modified organisms and derived products—Protein based methods;
——GB/T 19495.9 Detection of genetically modified organisms and derived products—Liquid bead array detection for plant products.
This part is Part 4 of GB/T 19495.
This part is developed in accordance with the rules given in GB/T 1.1-2009.
This part replaces GB/T 19495.4-2004 Detection of genetically modified organisms and derived products—Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods. In addition to editorial changes, the following main technical changes have been made with respect to GB/T 19495.4-2004:
——Detection methods for plant endogenous genes are added;
——Detection methods for screening genes of transgenic plants are added;
——Detection methods for structural genes are deleted and detection methods for strain specificity of crops such as soybean, maize, rape seeds, cotton, rice, potato, flax, sugar beet, etc. are added.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent rights. The issuing body of this document shall not be responsible for identifying any or all such patent rights.
This part was proposed by and is under the jurisdiction of the National Technical Committee on Plant Quarantine of Standardization Administration of China (SAC/TC 271).
The previous edition replaced by this part is as follows:
——GB/T 19495.4-2004.
Detection of genetically modified organisms and derived products—
Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods
1 Scope
This part of GB/T 19495 specifies the instruments and apparatus, reagents and materials, detection procedures, quality control, contamination-proof measures and minimum limit of detection of methods related to the screening of transgenic components and strain detection in plants and their processed products by qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR) methods.
This part is applicable to transgenic screening and detection of plants such as soybean, maize, rape, rice, cotton, potato, flax, beet, alfalfa, tomato, papaya, apple, endive, bentgrass, nicotiana tabacum, plum, muskmelon, wheat, eggplant and eucalyptus, and is also applicable to the detection for strain specificity of plants such as soybean, maize, rape, cotton, rice, potato, flax, sugar beet and papaya.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
GB/T 6682 Water for analytical laboratory use—Specification and test methods
GB/T 19495.2 Detection of genetically modified organisms and derived products—General requirements for laboratories
GB/T 19495.3 Detection of genetically modified organisms and derived products—Nucleic acid extraction
GB/T 19495.7 Detection of genetically modified organisms and derived products—Methods for sampling and sample preparation
GB/T 27403 Criterion on quality control of laboratories—Molecular biological testing of food
3 Terms, definitions and abbreviations
3.1 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1.1
transgene
technique in which a functional DNA sequence possessed by or derived from a species is bioengineered to be transcribed or expressed in the species in order to obtain a new trait of the species
3.1.2
real-time PCR
real-time polymerase chain reaction method in which a polymerase chain reaction system needs to add a fluorescent group whose fluorescence signal monitoring the entire PCR process in real time, and the unknown template is quantitatively analyzed by a standard curve
Note: The strength of the fluorescent signal directly reflects the number of templates.
3.1.3
endogenous gene
gene with constant copies and no allele changes were detected in the tested species
Note: This gene can be used to determine species specificity.
3.1.4
exogenous gene
other biological genes transferred using bioengineering techniques
Note: After transferring to an exogenous gene, the biological variety exhibits new biological traits.
3.1.5
cycle threshold
the number of cycles experienced by the fluorescent signal in each reaction tube reaching a set threshold
3.2 Abbreviations
For the purposes of this document, the following abbreviations apply.
Alfalfa-Acc: Alfalfa Acetyl-CoA carboxylase
BAR: Phosphinothricin acetyl-transference gene
bp: Base pair
CP4-EPSPS: Agrobacterium tumefaciens strain CP4 product: herbicide tolerant form of 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase
Cry IA(c): Bacillus thuringiensis (Bt) subsp. Kurstaki crystal protein IA(c)
Cry3A: Bacillus thuringiensis (Bt) subsp. Tenebrionis crystal protein 3A
CTAB: Cetyhrithylammonium bromide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosinc triphosphate
dCTP: Deoxyeytidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dNTP: Deoxyribonucleosidc triphosphate
dUTP: Deoxyuridine triphosphate
EDTA: Ethylene diaminetetraacetic acid
EPSPS: 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene
GAG56: One of 7-gliadin genes
GLuA3: Rice glutelin gene
GOX: Glyphosate oxidoreductase gene
LAT52: Pollen specific protein LAT52 gene
Lectin: Plant lectin gene
NPT II: Neomycin-3'-phosphotransferase gene
PAT: Phosphinothricin acetyltransferase gene
PCR: Polymerase chain reaction
PLD: Phospholipase D family gene
PMI: Phosphomannose-isomerase gene
pCaMV 35S: 35S promoter from cauliflower mosaic virus
pFMV 35S: 35S promoter from a modified figwort mosaic virus
pNOS: Promoter of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens
pSSuAra: The small subunit promoter of Arabidopsis
pTA29: Developmentally regulated pro-rooter from anther-specific TA29 gene from Nicotiana tabacum
pUbi: Promoter of maize Ubiquitin
SAH7: Sinapis arabidopsis homolog 7 gene
SDS: Sodium dodecylsulfate
SPS: Sucrose phosphate synthase gene
Taq: Taq DNA polymerase
TE: Tris-HCl, EDTA buffer
tE9: A terminator derived from the pea ribulose bisphosphate carboxylase gene
Tris: Tris (hydroxymethyl) aminomethane
T97: Transglutaminase 7 gene
tNOS: Terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens
tOCS: Terminator of octopine synthase
t35S: Cauliflower mosaic virus 35 teminator
UDG: Uracil DNA glycosylase
UGPase: UDP-glucose pyroph08phorylase gene from Solanum tuberosum
UNG enzyme: Uracil-N-glycosylase
Wx012: Waxy wheat genes
zSSII b: The endosperm-specific SS (starch synthasc) II b
18S rRNA: 18S ribosomal RNA
4 Principle
After extracting the sample DNA, real-time PCR technology was used to screen and detect the sample DNA, and the results of real-time PCR amplification were used to determine whether the sample contained transgenic ingredients. For samples that are positive for the detection of exogenous gene, or samples that are known to be positive for transgenes, if further strain identification is required, real-time PCR detection of the strain-specific fragments will be performed. Then the results were used to determine which of the transgenic strain(s) was(were) contained in the sample.
5 Instruments and apparatus, and reagents
5.1 Instruments and apparatus
5.1.1 Real-time PCR instrument.
5.1.2 Sample crusher or grinder.
5.1.3 Balance: with a sensibility of 0.01g.
5.1.4 Water bath or thermostat incubator.
5.1.5 Refrigerated centrifuge.
5.1.6 Autoclave.
5.1.7 Vortex oscillator.
5.1.8 Biological safety cabinet.
5.1.9 pH meter.
5.1.10 Nucleic acid protein analyzer or ultraviolet spectrophotometer.
5.1.11 Micropipettes (2 μL, 10 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL).
5.2 Main reagents
Unless otherwise specified, all reagents shall be analytical or biochemical reagents, and the experimental water shall meet the specifications of Class I water in GB/T 6682.
Foreword i
1 Scope
2 Normative references
3 Terms, definitions and abbreviations
4 Principle
5 Instruments and apparatus, and reagents
6 Procedure
7 Result judgment
8 Expression of results
9 Contamination-proof measures
10 Minimum limit of detection
Annex A (Informative) Primers and probes for screening and detection of transgenic ingredients by real-time PCR
Annex B (Informative) Primers and probes for detection of transgenic plant strain specificity by real-time PCR
ICS 65.020.01
B 16
中華人民共和國國家標(biāo)準
GB/T 19495.4—2018
代替GB/T 19495.4—2004
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測
實時熒光定性聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)
檢測方法
Detection of genetically modified organisms and derived products—
Qualitative real-time polymerase chain reaction(PCR)methods
2018—09—17發(fā)布 2019—04—01實施
國家市場監(jiān)督管理總局
中國國家標(biāo)準化管理委員會
發(fā)布
前 言
GB/T 19495《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測》分為如下幾部分：
——GB/T 19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 通用要求和定義；
——GB/T 19495.2 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實驗室技術(shù)要求；
——GB/T 19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 核酸提取純化方法；
——GB/T 19495.4 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測方法；
——GB/T 19495.5轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測方法；
——GB/T 19495.6轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 基因芯片檢測方法；
——GB/T 19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 抽樣和制樣方法；
——GB/T 19495.8轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 蛋白質(zhì)檢測方法；
——GB/T 19495.9轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 植物產(chǎn)品液相芯片檢測方法。
本部分為GB/T 19495的第4部分。
本部分按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。
本部分代替GB/T 19495.4—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定性PCR檢測方法》。與GB/T 19495.4—2004相比，除編輯性修改外，主要技術(shù)變化如下。
——增加了植物內(nèi)源基因的檢測方法；
——增加了轉(zhuǎn)基因植物篩選基因的檢測方法；
——刪除了結(jié)構(gòu)基因檢測方法，增加了大豆、玉米、油菜籽、棉花、水稻、馬鈴薯、亞麻和甜菜等作物的品系特異性檢測方法。
請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。
本部分由全國植物檢疫標(biāo)準化技術(shù)委員會(SAC/TC 271)提出并歸口。
本部分所代替標(biāo)準的歷次版本發(fā)布情況為：
——GB/T 19495.4—2004。
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測
實時熒光定性聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)
檢測方法
1 范圍
GB/T 19495的本部分規(guī)定了植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分篩選和品系檢測實時熒光定性聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測方法有關(guān)的儀器設(shè)備、試劑和材料、檢測步驟、質(zhì)量控制、防污染措施以及方法的最低檢出限。
本部分適用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、馬鈴薯、亞麻、甜菜、苜蓿、番茄、木瓜、蘋果、菊苣、剪股穎、煙草、李子、甜瓜、小麥、茄子和桉樹等植物轉(zhuǎn)基因篩選檢測，也適用于大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、馬鈴薯、亞麻、甜菜和木瓜等植物的品系特異性檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
GB/T 19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實驗室技術(shù)要求
GB/T 19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 核酸提取純化方法
GB/T 19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 抽樣和制樣方法
GB/T 27403 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測
3術(shù)語、定義和縮略語
3.1術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本文件。
3.1.1
轉(zhuǎn)基因transgene
將物種本身具有的或來源于其他物種的功能DNA序列，通過生物工程技術(shù)，使其在該物種中進行轉(zhuǎn)錄或表達，以便使該物種獲得新的品種特征的技術(shù)。
3.1.2
實時熒光PCR real-time polymerase chain reaction
實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)。在聚合酶鏈式反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，并通過標(biāo)準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
注：熒光信號的強弱直接反映模板數(shù)量。
3.1.3
內(nèi)源基因endogenom gene
在檢測物種中拷貝數(shù)恒定的、不顯示等位基因變化的基因。
注：該基因可用于判定物種特異性。
3.1.4
外源基因 exogenous gene
利用生物工程技術(shù)轉(zhuǎn)入的其他生物基因。
注；轉(zhuǎn)入外源基因后。該生物品種表現(xiàn)新的生物學(xué)性狀.
3.1.5
Ct值 cycle threshold
每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
3.2縮略語
下列縮略語適用于本文件。
Alfalfa-Acc：苜蓿乙酰輔酶a羧化酶(Alfalfa Acetyl-CoA carboxylase)
BAR：磷化麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(phosphinothricin acetyltranSferase gene)
bp：堿基對(base pair)
CP4-EPSPS：農(nóng)根菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(Agrobacterium tumefaciens strain CP4 Product：herbicide tolerant form of 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase)
Cry I A(c)：蘇云晶芽飽桿菌殺蟲蛋門Cry I A(c)基因[Bacillus thuringiensis(Bt)subsp. Kurstaki crystal protein I A(c)]
Cry3A：蘇云晶芽孢桿菌殺蟲蛋白Cry3A基因[Bacillus thuringiensis(Bt)subsp.Tenebrionis crystal protein 3A]
CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyhrithylammonium bromide)
DNA：脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dATP：脫氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinc triphosphate)
dCTP：脫氧胞苷三磷酸(deoxyeytidine triphosphate)
dGTP：脫氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)
dNTP：脫氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidc triphosphate)
dUTP：脫氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)
EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)
EPSPS：5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene)
GAG56：一種醇溶蛋白基因(one of 7-gliadin genes)
GLuA3：大米谷蛋白基因(rice glutelin gene)
GOX：草甘膦氧化還原酶基因(glyphosate oxidoreductase genc)
LAT52：花粉特異蛋白LAT52基因
Lectin：植物凝集素基因
NPT Ⅱ：新霉素-3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycin-3′-phosphotransferase gene)
PAT：草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)
PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction)
PLD：磷脂酶D家族基因(phospholipase D family gene)
PMI：6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(phosphomannose-isomerase gene)
pCaMV 35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子(35S promoter from cauliflower mosaic virus)
pFMV 35S：玄參花葉病毒35S啟動子(35S promoter from a modified figwort mosaic virus)
pNOS：來源于農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因啟動子(promoter of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens)
pSSuAra：來自擬南芥的小亞基啟動子(the small subunit promoter of Arabidopsis)
pTA29：來源于煙草的花蕊特異性TA29基因的發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子(developmentally regulated pro-rooter from anther-specific TA29 gene from Nicotiana tabacum)
pUbi：玉米泛素基因的啟動子(promoter of maize Ubiquitin)
SAH7：類擬蘭芥屬同源序列7的棉花內(nèi)源基因(sinapis arabidopsis homolog 7 gene)
SDS：十二烷基磺酸鈉(sodium dodecylsulfate)
SPS：蔗糖磷酸鹽合成酶基因(sucrose phosphate synthase gene)
Taq：DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)
TE：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、乙二胺四乙酸二鈉緩沖液(Tris-HCl、EDTA buffer)
tE9：為來源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的終止子
Tris：三(羥甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
t97：谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶7基因(transglutaminase 7gene)
tNOS：來源于農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因終止子(terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens)
tOCS：章魚堿合成酶終止子(terminator of octopine synthase)
t35S：花椰菜花葉病毒終止子(Cauliflower mosaic virus 35 teminator)
UDG：尿嘧啶DNA-糖基酶(uracil DNA glycosylase)
UGPase：馬鈴薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-glucose pyroph08phorylase gene from Solanum tuberosum)
UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase)
Wx012：小麥蠟質(zhì)基因(waxy wheat genes)
zSSⅡ b：玉米淀粉合成酶b亞基[the endosperm-specific SS(starch synthasc)Ⅱ b]
18S rRNA：真核生物核糖體小亞基18S基因(18S ribosomal RNA)
4方法原理
提取樣品DNA后，通過實時熒光PCR技術(shù)對樣品DNA進行篩選檢測，根據(jù)實時熒光PCR擴增結(jié)果.判斷該樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。對外源基因檢測結(jié)果為陽性的樣品，或已知為轉(zhuǎn)基因陽性的樣品.如需進一步進行品系鑒定，則對品系特異性片段進行實時熒光PCR檢測，根據(jù)結(jié)果判定該樣品中含有哪(些)種轉(zhuǎn)基因品系成分。
5儀器設(shè)備和試劑
5.1 儀器設(shè)備
5.1.1實時熒光PCR儀。
5.1.2樣品粉碎儀或研磨機。
5.1.3天平：感量0.01 g。
5.1.4水浴鍋或恒溫孵育器。
5.1.5冷凍離心機。
5.1.6高壓滅菌鍋。
5.1.7渦旋振蕩器。
5.1.8生物安全柜。
5.1.9 pH計。
5.1.10核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。
5.1.11 微量移液器(2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)。
5.2主要試劑
除特別說明外，所有試劑均為分析純或生化試劑，實驗用水應(yīng)符合GB/T 6682中一級水的規(guī)格。
5.2.1實時熒光PCR預(yù)混液
為Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2(3 mmol/L～7 mmol/L)、dNTPs(含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶等混合配制的溶液。
5.2.2 ROX
熒光校正試劑(50×，使用時稀釋至1×)。
5.2.3引物和探針
5.2.3.1篩選檢測引物探針
篩選檢測基因的引物和探針參照附錄A中表A.1的序列合成，加超純水配制成100μmol/L儲備液，實時熒光PCR擴增的引物和探針工作液濃度為10μmol/L。
5.2.3.2 品系特異性檢測引物探針
根據(jù)需要檢測的轉(zhuǎn)基因植物品系，參照附錄B中表B.1的序列合成引物和探針，加超純水配制成100 μmol/L儲備液，實時熒光PCR擴增的引物和探針工作液濃度為10 μmol/L。
6檢測步驟
6.1取樣和制樣
按照GB/T 19495.7中規(guī)定的方法執(zhí)行。
6.2樣品DNA的提取與純化
按照GB/T 19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。每個樣品應(yīng)制備2個測試樣品提取DNA(提取平行重復(fù))。
6.3 DNA濃度測定和定量
按照GB/T 19495.3中規(guī)定的方法執(zhí)行。
6.4實時熒光PCR檢測
6.4.1 轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測基因的選擇
對于未知是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的樣品.按照表1選用篩選基因進行檢測。
表1轉(zhuǎn)基因篩選檢測基因選用
物種 選用基因
大豆及其加工品 內(nèi)源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，BAR，PAT，GOX.CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS，tE9
玉米及其加工品 內(nèi)源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，BAR，PAT，GOX，CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS，Cry3A，tCaMV 35S，PMI，Cry I A(b)，CRY I A(c)，pRice-Eactin
表1(續(xù))
物種 選用基因
油菜及其加工品 內(nèi)源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS.NPT Ⅱ，BAR，PAT，GOX，CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS，pNOS，pSSuAra，pTA29，tCaMV 35S，tE9，tOCS，tg7
水稻及其加工品 內(nèi)源基因，pCoMV 35S，tNOS，BAR，Cry I A(b)，CRY I A(c)
棉花及其加工品 內(nèi)源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，BAR，PAT，CP4-EPSPS，pUbi，tE9，Cry I A(b)，CRY I A(c)
馬鈴薯及其加工品 內(nèi)源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，CP4-EPSPS，Cry3A，pNOS
亞麻及其加工品 內(nèi)源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
甜菜及其加工品 內(nèi)源基因，pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，PAT，CP4-EPSPS，CTP2-CP4-EPSPS
苜蓿及其加工品 內(nèi)源基因，pFMV 35S，CTP2-CP4-EPSPS，tE9
番茄 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPTⅡ，CRY I A(c)
蘋果 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
菊苣 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，BAR，NPT Ⅱ
剪股穎 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，CP4-EPSPS
煙草 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
李子 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
甜瓜 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
木瓜 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ
小麥 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，CP4-EPSPS
茄子 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NPT Ⅱ，CRY I A(c)
桉樹 pCaMV 35S，pFMV 35S，tNOS，NFT Ⅱ
6.4.2實時熒光PCR反應(yīng)體系
實時熒光PCR反應(yīng)體系配制見表2。每個樣品設(shè)置2個平行重復(fù)。
表2實時熒光PCR檢測體系
名稱 儲液濃度 終濃度
10×PCR緩沖液 10× 1×
MgCl2 25 mmol/L 2.5 mmol/L
dNTP(含dUTP) 2.5 mmol/L 0.2 mmol/L
UNG酶 5 U/μL 0.075 U/μL
上游引物 10 μmol/L 見表A.1、表B.1
下游引物 10 μmol/L 見表A.1、表B.1
探針 10 μmol/L 見表A.1、表B.1
Taq酶 5 U/μL 0.05 U/μL
表2(續(xù))
名稱 儲液濃度 終濃度
DNA模板 50 ng～250 ng
超純水 補足至25μL
注1：可選用含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTP和Taq藩等成分的基于Taqman探針的實時熒光PCR預(yù)混液進行實時熒光PCR擴增。
注2：ROX熒光試劑僅在具有ROX校正通道的實時熒光PCR儀上進行擴增時添加，否則用超純水補足。
注3：反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進行適當(dāng)調(diào)整。
6.4.3實時熒光PCR反應(yīng)程序
實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：50℃/2 min；95℃/10 min，95℃/15 s，60℃/60 s，40個循環(huán)。
注：95℃/10 min的專門適用于化學(xué)變構(gòu)的熱啟動Taq酶，以上參數(shù)可根據(jù)不同塑號實時熒光PCR儀和所選PCR擴增試劑體系不同作調(diào)整。
6.4.4儀器檢測通道的選擇
將PCR反應(yīng)管或反應(yīng)板放入實時熒光PCR儀后，設(shè)置PCR反應(yīng)熒光信號收集條件，應(yīng)與探針標(biāo)記的報告基團一致。具體設(shè)置方法可參照儀器使用說明書。
6.4.5實驗對照的設(shè)立
實驗設(shè)置如下對照：
——陽性對照，為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物品系基因組DNA，或含有上述片段的質(zhì)粒標(biāo)準分子DNA；
——陰性對照，相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物樣品DNA；
——空白對照，設(shè)兩個，一是提取DNA時設(shè)置的提取空白對照(以雙蒸水代替樣品)，二是PCR反應(yīng)的空白對照(以雙蒸水代替DNA模板)。
7結(jié)果判定
7.1 質(zhì)量控制
下述指標(biāo)有一項不符合者，需重新進行實時熒光PCR擴增。
——空白對照：內(nèi)源基因檢測Ct值≥40，外源基因或品系特異性檢測Ct值≥40；
——陰性對照：內(nèi)源基因檢測Ct值≤30，轉(zhuǎn)化事件特異性檢測Ct值≥40；
——陽性對照，內(nèi)源基因檢測Ct值≤30，轉(zhuǎn)化事件特異性檢測Ct值≤35。
7.2 結(jié)果判定
測試樣品外源基因檢測Ct值≥40，內(nèi)源基因檢測Ct值≤30，則可判定該樣品不含所檢基因或品系。
測試樣品外源基因檢測Ct值≤35，內(nèi)源基因檢測Ct值≤30，判定該樣品含有所檢基因或品系。
測試樣品外源基因檢測Ct值在35～40，應(yīng)調(diào)整模板濃度，重做實時熒光PCR。再次擴增后的外源基因檢測Ct值仍在35～40，則可判定為該樣品含有所檢基因或品系。再次擴增后的外源基因檢測Ct值≥40，則可判定為該樣品不含所檢基因或品系。
8結(jié)果表述
結(jié)果為陽性的，表述為“檢出×××外源基因”或“檢出×××轉(zhuǎn)基因品系”。
結(jié)果為陰性的，表述為“未檢出×××外源基因”或“未檢出×××轉(zhuǎn)基因品系”。
對于核酸無法有效提取的樣品，檢測結(jié)果為“未檢出核酸成分”。
9防污染措施
檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403和GB/T 19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。
10最低檢出限
各基因片段的實時熒光PCR擴增的最低檢出限(LOD)為0.01％。
附 錄A
(資料性附錄)
轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測實時熒光FCR引物和探針
轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測用引物探針序列見表A.1。
表A.1 轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測實時熒光PCR引物和探針序列信息表
序號 基因/品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp 適用范圍
1 18S rDNA F cctgagaaacggctacca 400 65 植物內(nèi)源基因
R cgtgtcaggattgggtaat 400
P FAM-tgcgcgcctgctgccttcct-BHQ1 200
2 HMGI/Y F ggtcgtcctcctaaggcgaaag 400 99 油菜內(nèi)源基因
R cttcttcggcggtcgtccac 400
P FAM-cggagccactcggtgccgcsactt-BHQ1 200
3 CruA F ggccagggtttccgtgat 200 101
R ccgtcgttgtagaaccattgg 200
P FAM-agtccttatgtgctccactttctggtgca-BHQ1 200
4 adh1 F cgtcgtttcccatctcttcctcc 300 135 玉米內(nèi)源基因
R ccactccgagaccctcagtc 300
P FAM-aatcagggctcattttctcgctcctca-BHQ1 200
5 zSSⅡb F ctcccaatcctttgacatctgc 500 151
R tcgatttctctcttggtgacagg 500
P FAM-agcaaagtcagagcgctgcaatgca-TAMRA 200
6 Lectin F cctcctcgggaaagttacaa 150 74 大豆內(nèi)源基因
R gggcatagaaggtgsagtt 150
P FAM-ccctcgtctcttggtcgcgccctct-BHQ1 50
7 Lectin-KVM F cacctttctcgcaccaattgaca 200 104
R tcaaactcaacagcgacgac 200
P FAM-ccacaaacacatgcaggttatcttgg-BHQ1 200
8 LAT52 F agaccacgagaacgatatttgc 400 92 番茄內(nèi)源基因
R ttcttgccttttcatatccagaca 400
P FAM-ctctttgcagtcctcccttgggct-BHQl 200
9 SPS F cacctttctcgcaccaattgaca 200 104 水稻內(nèi)源基因
R tcaaactcaacagcgacgac 200
P FAM-tccgagccgtccgtgcgtc-BHQ1 200
表A.1(續(xù))
序號 基因/品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp 適用范圍
10 PLD F tggtgagcgttttgcagtct 200 64 水稻內(nèi)源基因
R ctgatccactagcaggaggtcc 200
P FAM-tgttgtgctgccaatgtggcctg-BHQ1 200
11 GOS F tggtgagcgttttgcagtct 200 67
R ctgatccactagcaggaggtcc 200
P FAM-tgttgtgctgccaatgtggcctg-BHQ1 200
12 UGPase F ggacatgtgaagagacggagc 400 88 馬鈴薯內(nèi)源基因
R cctacctctacccctccgc 400
P FAM-ctaccaccattacctcgcacctcctca-BHQ1 200
13 SAH7 F agtttgtaggttttgatgttacattgag 350 115 棉花內(nèi)源基因
R gcatctttgaaccgcctactg 250
P FAM-aaacataaaataatgggaacaaccatgacatgt-BHQ1 175
14 GLuA3 F gacctccatattactgaaaggaag 150 121 甜菜內(nèi)源基因
R gagtaattgctccatcctgttca 150
P FAM-ctacgaagtttaaagtatgtgccgctc-BHQ1 100
15 GAG56 F caacaattttctcagccccaaca 200 121 小麥屬內(nèi)源基因
R tcttgcatgggttcacctgtt 200
P FAM-ttcccgcagccccaacaaccgc-BHQ1 200
16 Wx012 F gtcgcgggaacagaggtgt 500 102 小麥種內(nèi)源基因
R ggtgttcctccattgcgaaa 500
P FAM-caaggcggccgaaataagttgcc-BHQ1 200
17 Alfalfa-Acc F gatcagtgaacttcgcaaagtac 400 90 苜蓿內(nèi)源基因
R caacgacgtgaacactacaac 400
P FAM-tgaatgctcctgtgatctgcccatgc-TAMRA 200
18 CHY F ccatgcggatcctccca 500 74 木瓜內(nèi)源基因
R catcgtagccattgtaacactagctaa 500
P FAM-ttcccttcatccattcccactcttgaga-BHQ1 200
19 pCaMV 35S F gcctctgccgacagtggt 100 82 轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、番茄、馬鈴薯、番木瓜等外源篩選基因
R aagacgtggttggaacgtcttc 100
P FAM-caaagatggacccccacccacg-BHQ1 100
表A.1(續(xù))
序號 基因/品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp 適用范圍
20 pFMV 35S F cgaagacttaaagttagtgggcatct 400 79 轉(zhuǎn)基因大豆、油菜、馬鈴薯、番茄、玉米、棉花和苜蓿等篩選檢測
R ttttgtctggtccccacaa 400
P FAM-tgaaagtaatcttgtcaacatcgagcagctgK-RHQ1 200
21 tNOS F atcgttcaaacatttggca 400 165 轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻、油菜、棉花、小麥、番茄、馬鈴薯、番木瓜等篩選檢測
R attgcgggactctaatcata 400
P FAM-catcgcaagaccggcaacagg-BHQ1 200
22 NPTⅡ F aggatctcgtcgtgacccat 400 183 轉(zhuǎn)基因油菜、棉花、玉米、甜菜、番茄、馬鈴薯、番木瓜等篩選檢測
R gcacgaggaagcggtca 400
P FAM-cacccagccggccacagtcgat-BHQ1 200
23 BAR F acaagcacggtcaacttcc 400 175 轉(zhuǎn)基因油菜、玉米、小麥、棉花、水稻、大豆等篩選檢測
R actcggccgtccagtcgta 400
P FAM-ccgagccgcaggaaccgcaggag-BHQ1 200
24 PAT F gtcgacatgtctccggagag 400 191 轉(zhuǎn)基因油菜、玉米、棉花、大豆、甜菜等篩選檢測
R gcaaccaaccaagggtatc 400
P FAM—tggccgcggtttgtgatatcgttaa-BHQ1 200
25 GOX F gtcttcgtgttgctggaaccgtt 400 121 轉(zhuǎn)基因油菜、玉米、甜菜等篩選檢測
R gaactggcaggagcgagagct 400
P FAM-tgctcacgttctctacactcgcgctcg-BHQ1 200
26 CP4-EPSPS F gcaaatcctctggcctttcc 100 146 轉(zhuǎn)基因油菜、大豆、玉米、棉花、馬鈴薯、甜菜、小麥等篩選檢測
R cttgcccgtattgatgacgtc 100
P FAM-tcatgttcggcggtctcgcg-BHQ1 200
27 Cry3A F Tccggttacgaggttctt 400 86 轉(zhuǎn)基因玉米、馬鈴薯等篩選
檢測
R ccatagatttgagcgtcctta 400
P FAM-acctatgctcaagctgccaacaccc-BHQ1 200
28 pNOS F gtgaccttaggcgacttttgaac 340 79 轉(zhuǎn)基因油菜、
馬鈴薯
R cgcgggtttctggagtttaa 340
P FAM-cgcaataatggtttctgacgtatgtgcttagc-BHQ1 400
表A.1(續(xù))
序號 基因/品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp 適用范圍
29 pSSuAra F ggcctaaggagaggtgtggaga 340 95 轉(zhuǎn)基因油菜、對擬南芥是內(nèi)源基因
R ctcatagataacgataagattcatggaatt 340
P FAM-ccttatcggcttgaaccgctggaataa-BHQ1 400
30 pTA29 F gaagctgtgctagagaagatgtttattc 340 117 轉(zhuǎn)基因油菜、對煙草是內(nèi)源基因
R gctcgaagtatgcacatttagcaa 340
P FAM-agtccagccacccaccttatgcaagtc-BHQ1 400
3l pUbi F gagtagataatgccagcctgtmaac 340 76 轉(zhuǎn)基因棉花、對玉米是內(nèi)源基因
R acgcgacgctgctggtt 340
P FAM-cgtcgacgagtctaacggacaccaac-BHQ1 400
32 tCaMV 35S F ggggtttcttatatgctcaacacatg 340 118 轉(zhuǎn)基因玉米、
油菜
R tcaccagtctctctctacaaatctatcac 340
P FAM-aaaccctataagaacccumttcccttatctggge-BHQ1 400
33 tE9 F tgagaatgaacaaaaggaccatatca 200 87 轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、棉花、對豌豆是內(nèi)源基因
R tttttattcggttttcgctatcg 200
P FAM-tcattaactcttctccatccatttccatttcacagt-BHQ1 200
34 tOCS F cggtcaaacctaaaagactgattaca 340 85 轉(zhuǎn)基因油菜
R cgctcggtgtcgtagatact 340
P FAM-tcttatteaaatttcaaaagtgccccaggg-BHQ1 400
35 tg7 F atgcaagtttaaattcagaaatatttcaa 340 97 轉(zhuǎn)基因油菜
R atgtattacacataatatcgcactcagtct 340
P FAM-actgattatatcagctggtacattgccgtagatga-BHQ1 400
36 PMI F Ccgggtgaatcagcgttt 200 59 轉(zhuǎn)基因玉米
R Gccgtggcctttgacagt 200
P FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-BHQ1 200
37 Cry I A(b) F cgcgactggatcaggtaca 400 75 轉(zhuǎn)基因大米、玉米、棉花等外源篩選基因
R tggggaacaggctcacgat 400
P FAM-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-BHQ1 200
38 CRY I A(c) F cggaaatgcgtattcaattcaac 400 71 任選其一，轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、棉花
R ttctggactgcgaacaatgg 400
P FAM-acatgaacagcgccttgaccacagc-BHQ1 200
39 CRY I A(c) F gaccctcacagttttggacattg 400 93
R atttctctggtaagttgggacact 400
P FAM-tcccgaactatgactccagaaectaccctatcc-BHQ1 200
表A.1(續(xù))
序號 基因/品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp 適用范圍
40 pRice-Eactin F tcgaggtcattcatatgcttgag 340 95 轉(zhuǎn)基因玉米、對大米是內(nèi)源基因
R ttttaactgatgttttcacttttgacc 340
P FAM-agagagtcgggatagtccaaaataaaacaaaggta-BHQ1 400
41 CTP2-CP4-EPSPS F gggatgacgttaattggctctg 375 88 轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、苜蓿
R ggctgcttgcaccgtgaag 375
P FAM-cacgccgtggaaacagaagacatgacc-BHQ1 150
附 錄B
(資料性附錄)
轉(zhuǎn)基因植物品系特異性實時熒光PCR檢測引物探針
轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測用引物探針序列見表B.1。
表B.1 轉(zhuǎn)基因植物品系特異性實時熒光PCR檢測引物和探針序列信息表
作物 品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp
大豆 GTS40-3-2 F ttcattcaaaataagatcatacatacaggtt 150 84
R ggcatttgtaggagccacctt 150
P FAM-ccttttccatttggg-MGBNFQ 50
MON89788 F tcccgctctagcgcttcaat 150 139
R tcgagcaggacctgcagaa 150
P FAM-ctgaaggcgggaaacgacaatctg-TAMRA 50
A2704-12 F gcaaaaaagcggttagctcct 400 64
R attcaggctgcgcaactgtt 400
P FAM-cggtcctccgatcgcccttcc-TANLRA 200
A5547-127 F gctatttggtggcmtttttcca 400 75
R cactgcggccaacttacttct 400
P FAM-ccgcaatgtcataccgtcatcgttgt-TAMRA 200
DP305423 F cgtgttctctttttggctagc 800 93
R gtgaccaatgaatacataacacaaacta 500
P FAM-tgacacaaatgattttcatacaaaagtcgaga-TAMRA 220
DP356043 F gtcgaataggctaggtttacgaaaaa 750 99
R tttgatattcttggagtagacgagagtgt 750
P FAM-ctctagagatccgtcsacatggtggagcac-TAMRA 200
MON87701 F cgtttcccficcttcagtttaaa 600 89
R tggtgatatgaagatacatgcttagcat 600
P FAM-tcagtgtttgacacacacactaagcgtgcc-TAMRA 250
CV127 F aacagaagtttccgttgagctttaagac 400 88
R cattcgtagctcggatcgtgtac 400
P FAM-tttggggaagctgtcccatgccc-TAMRA 100
MON87705 F ttcccggacatgaagccatttac 450 86
R acaacggtgccttggcccaaag 450
P FAM-aagagactcagggtgttgttatcactgcgg-TAMRA 250
表B.1(續(xù))
作物 品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp
大豆 MoN87769 F catactcattgctgatccatgtagatt 600 87
R gcaagttgctcgtgsagttttg 600
P FAM-cccggacatgaagccatttacaattgac-TAMRA 200
FG72 F agatttgatcgggctgcagg 400 70
R gcacgtattgatgaccgcatta 400
P FAM-aatgtggtteatccgtctt-MGBNFQ 200
MON87708 F tcatactcattgctgatccatgtag 300 91
R agaacaaattaacgaaaagacagaacg 300
P FAM-tcccggactttagctcaaaatgcatgta-TAMRA 150
玉米 GA2l F cgttatgctatttgcaactttagaaca 150 112
R gcgatcctcctcgcgtt 1S0
P FAM-tttctcaacagcaggtgggtccgggt-TAMRA 50
NK603 F atgaatgacctcgagtaagcttgttaa 150 108
R aagagataacaggatccactcaaacact 150
P FAM-tggtaccacgcgacacacttccactc-TAMRA 50
Btll F tgtgtggccatttatcatcga 200 68
R cgctcagtggaacgaaaactc 200
P FAM-ttccatgacceaaatcccttaacgtgagt-TAMRA 150
Bt176 F ggccgtgaacgagctgtt 300 82
R gggaagaagcctacatgttttctaa 300
P FAM-agcaaccagatcggccgacacv-TAMRA 200
MON810 F tcgaaggacgaaggactctaacgt 300 92
R gccaccttccttttccactatctt 300
P FAM-aacatcctttgccattgcccagc-TAMRA 180
MON863 F gtaggatcggaaagcttggtac 150 70
R tgttacggcctaaatgctgaact 150
P FAM-tgaacacccatccgaacaagtagggtca-TAMRA 50
T25 F acaagcgtgtcgtgctccac 400 102
R gacatgatactccttccaccg 400
P FAM-tcattgagtcgttccgccattgtcg-TAMRA 200
CBH351 F Tgttactagatcgcagatcctct 400 96
R ctagaaggcaattctaattgatc 400
P FAM-gtcgacctgcaggcatgcaaggaattccatt-TAMRA 200
表B.1(續(xù))
作物 品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp
玉米 TC1507 F tagtcttcggccagaatgg 300 58
R ctttgccaagatcaagcg 300
P FAM-taactcaaggccctcactccg-TAMRA 150
59122 F 989ataagcaagtaaaagcgctc 250 86
R ccttaattctccgctcatgatcag 250
P FAM-tttaaactgaaggcgggaaacgacaa-TAMRA 200
MIR604 F gcgcacgcaattcaacag 600 76
R ggtcataacgtgactcccttaattct 300
P FAM-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-TAMRA 200
3272 F tcatcegsccagattctcttttstgtgg 50 95
R cgtttcccgccttcagttta 900
P FAM-actgctgacgcggccaaacactg-TAMRA 200
LY038 F tgggttcagtctgcgaatgtt 150 111
R aggaattcgatatcaagcttatcga 160
P FAM-cgagcggagtttatgggtcgacgg-TAMRA 50
MON89034 F ttctccatattgsccttcatactcatt 450 77
R csgtatctataataccgtggtttttaaa 450
P FAM-atccccggaaattatl4tt-MGBNFQ 100
MON88017 F gagcaggacctgcagaagct 150 95
R tccggagttgaccatcca 150
P FAM-tcccgccttcagtttaaacagagtcgggt-TAMRA 50
98140 F gtgtgtatgtctctttgcttggtctt 500 80
R gattgtcgtttcccgccttc 500
P FAM-ctctatcgatccccctctttgatagtttaaact-TAMRA 200
MIR162 F gcgcggtgtcatctatgttactag 300 92
R tgccttatctgttgccttcaga 300
P FAM-tctagacaattcagtacattaaaaacgtccgcca-TAMRA 150
DAS40278 F cacgaaccattgagttacaatc 350 98
R tggttcattgtattctggctttg 350
P FAM-egtagctaaccttcattgtattccg-TAMRA 150
MON87460 F cacgttgaaggaaaatggattg 600 82
R tcgcgatcctcctcaaagac 600
P FAM-agggagtatgtagataaattttcaaagcgttagacggc-TAMRA 250
表B.1(續(xù))
作物 品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp
棉花 MON531 F tcccattcgagtttctcacgt 150 72
R aaccaatgccaccccactga 150
P FAM-ttgtccctccacttcttctc-TAMRA 50
MON1445 F ggagtaagacgattcagatcaaacac 150 87
R atcgacctgcagcccaagct 150
P FAM-atcagattgtcgtttcccgccttcagttt-TAMRA 50
MON15985 F gttactagatcgggatatcc 150 82
R aaggttgctaaatggatggga 150
P FAM-ccgctctagaactagtggatctgcactgaa-TAMRA 50
MON88913 F ggctttggctaccuaagagagtc 500 94
R caaattacccattaagtagccasattac 500
P FAM-aactatcagtgtttgactacat-MGBNFQ 100
LLCotton25 F cagatttttgtgggattggaattc 400 79
R caaggaactattcaactgag 400
P FAM-cttaacagtactcggccgtcgaccgc-TAMRA 200
GHB614 F caaatacacttggaacgacttcgt 400 119
R gcaggcatgcaagcttttaaa 400
P FAM-ctccatggcgatcgctacgttctagaatt-TAMRA 200
281-24-236 F ctcattgctgatccatgtagatttc 350 111
R ggacaatgctgggctttgtg 450
P FAM-ttgggttaataaagtcagattagagggagacaa-TAMRA 175
3006-210-23 F aaatattaacaatgcattgagtatgatg 400
R actctttctttttctccatattgacc 400 90
P FAM-tactcattgctgatccatgtagatttcccg-TAMRA 150
T304-40 F agcgcgcaaactaggataaatt 400 78
R cctagatcttgggataacttgaaaaga 400
P FAM-tcgcgcgcggtgtcatctatctc-TAMRA 200
GBH119 F ccagtactaaaatccagatcatgca 400 90
R gaaattgcgtgactcaaattcc 400
P FAM-cctgcaggtcgacggccgagtac-TAMRA 200
水稻 TT51-1(Bt63) F agagactggtgatttcagcggg 400 119
R gcgtccagaaggaaaaggaata 400
P FAM-atctgccccagcactcgtccg-TAMRA 200
表B.1(續(xù))
作物 品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp
水稻 LLRice62 F agctggcgtaatagcgaagagg 400 88
R tgctaacgggtgcatcgtcta 400
P FAM-cgcaccgattatttatacttttagtccacct-TAMRA 200
LLRice601 F tctaggatccgaagcagatcgt 400 68
R ggagggcgcggagtgt 400
P FAM-ccacctcccaacaataaaagcgcctg-TAMRA 200
114-7-2 F ccgacgcggaggaagac 400 69
R cgtttcccgccttcagttta 400
P FAM-cggaggcggcgtcaaacactg-TAMRA 200
Kefeng 6 F gcttggatcagattgtcgttt 400 154
R gtcagataaactgattggtctgat 400
P FAM-cgacaaaagatcaggatttggg-ECLIPSE 200
Kefeng 8 F atattctgaagtggcctgtt 400 171
R cgaccatgatgctgttctgc 400
P FAM-cgttatttatgagatgggtgatctcacccatgcttg-TAMRA 200
KMD1 F tccgcaatgtgttattaagttgtctaa 300 78
R ccgatatgcctgcccatct 900
P FAM-cgtcaatttgtttacaccacaatatatcccg-TAMRA 100
油菜 GT73(RT73) F ccatattgaccatcatactcattgct 150 108
R gcttatacgaaggcaagaaaagga 150
P FAM-ttcccggacatgaagatcatcctcctt-TAMRA 50
MS8 F gttagaaaaagtaaacaattaatatagccgg 400 130
R ggagggtgtttttggttatc 400
P FAM-aatataatcgacggatccccgggaattc-TAMRA 200
MS1 F acgctgcggacatctacatt 400 187
R ctagatcggaagctgaagatgg 400
P FAM-ctcattgctgatccacctagccgactt-TAMRA 200
RF1 F ctaagggaggtcaagatgtagc 400 113
R cgggcctaacttttggtgtg 400
P FAM-ctcatcatcctcacccagtcagcatca-TAMRA 200
RF2 F gggtgagacaatatatcgacg 200 104
R gggcatcgcaccggtgag 200
P FAM-caccggccaaattcgctcttasccgt-TAMRA 200
表B.1(續(xù))
作物 品系名稱 引物/探針序列(5′-3′) 終濃度
nmol/L 產(chǎn)物大小
bp
油菜 RF3 F cataaaggaagatgafagacttgag 400 139
R agcatttagcatgtaccatcagaca 400
P FAM-cgcacgcttatcgaccataagccca-TAMRA 200
Oxy-235 F ctaacttttggtgtgatgatgctga 400 124
R cgatagatggtggtgtgagtcttg 400
P FAM-agctgatggcaagttaatctccccgaagtcg-DABCYL 200
T45 F caatggacacatgaattatgc 400 123
R gactctgtatgaactgttcgc 400
P FAM-tagaggacctaacagaactcgccgt-TAMRA 200
Topas19/2 F gcggttctgtcagtt 400 95
R cgaccggcgctgatatatga 400
P FAM-tcccgcgtcatcggcgg-TAMRA 200
73496 F gttcttctcttcatagctcattacagtttt 600 84
R caaacctccatagagttcaacatcttaa 600
P FAM-ttagttagatcaggatattcttg-MGBNFQ 250
MON88302 F tcccttgaaccttattttatagtgcaca 450 10l
R tcagattgtcgtttcccgccttca 450
P FAM-tagtcatcatgttgtaccacttcaaacact-BHQ1 200
馬鈴薯 EH92-527-1 F gtgtcaaaacacaatttacagca 300 134
R tcccttaatttctccgctcatga 300
P FAM-agattgtcgtttcccgccttcagtt-TAMRA 160
亞麻 Fp967 F agcgcgcaaactaggataaa 800 105
R accttccggctcgatgtcta 800
P FAM-cgcgcgcggtgtcatctatg-BHQ1 100
甜菜 H7-1 F tgggatctgggtggctctaact 400 108
R aatgctgctaaatcctgag 400
P FAM-aaggcgggaaacgacaatct-TAMRA 100
木瓜 Huanong No.1 F gacgagtacaaggagacgcc 400 174
R gttgtcactgaagcgggaag 400
P FAM-tggctgctattgggcgaatcaactac-BHQ1 200
