標準編號:	GB 5413.20-2013
中文名稱:	食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定
英文名稱:	National Food Safety Standard Determination of choline in infant foods and dairy products
中標分類:	X09    衛生、安全、勞動保護
行業分類:	GB    國家標準
發布機構:	國家衛生和計劃生育委員會
發布日期:	2013-11-29
實施日期:	2014-6-1
標準狀態:	superseded
被新標準替代:	GB 5413.20-2022 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定
被替代日期:	2022-12-30
替代舊標準:	GB 5413.20-1997 GB/T 5413.20-1997 嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測定
翻譯語言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符數:	6,000 字
翻譯價格(元):	290.0
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Codeofchina.com is in charge of this English translation. In case of any doubt about the English translation, the Chinese original shall be considered authoritative. This standard supersedes GB/T 5413.20-1997 "Milk Powder and Formula Foods for Infant and Young Children — Determination of Choline". Compared with GB/T 5413.20-1997, the main changes in this standard are as follows: — The standard name was modified; — Developer composition used for enzyme reaction was modified; — Method II Reinecke's Salt Spectrophotometry was added. National Food Safety Standard — Foods and Milk Products for Infant and Young Children — Determination of Choline 1 Scope This standard specifies the method for determination of choline in foods and milk products for infants and young children. This standard is applicable to the determination of choline in foods and milk products for infants and young children. Method 1: Enzyme-colorimetric Method 2 Principle Choline in the sample will be change into free form after acid hydrolysis, then after enzymatic oxidation and react with developer to produce coloring matter, which of the colour concentration within a certain range is proportional to the content of choline. 3 Reagents and Materials Note: Unless otherwise specified, reagents used in this method are all analytical reagent, water is Grade 3 water specified in GB/T 6682. 3.1 Reagents 3.1.1 Tris [(CH2OH)3CNH2]. 3.1.2 Phenosalyl (C6H5OH). 3.1.3 Concentrated hydrochloric acid (HCl). 3.1.4 Sodium hydroxide (NaOH ). 3.1.5 Choline oxidase: stored at -20 ℃. 3.1.6 Peroxidase: stored at 2 ℃ to 8 ℃. 3.1.7 4-aminoantipyrine (C11H13N3O) . 3.1.8 Phospholipase D: stored at -20 ℃. 3.2 Reagent preparation 3.2.1 Hydrochloric acid (1 mol/L): measuring off 85 mL concentrated hydrochloric acid and dilute to 1000 mL with water. 3.2.2 Hydrochloric acid (3 mol/L): measuring off 125 mL concentrated hydrochloric acid and dilute to 500 mL with water. 3.2.3 Tris buffer solution(0.05 mol/L): pH =8.0 ± 0.2. Dissolve 6.057 g tris into 500 mL distilled water, neutralize with 1 mol/L hydrochloric acid to pH value 8.0 ± 0.2, and then dilute to constant volume (1000 mL) with distilled water. This solution may be stored in refrigerator at 4℃ for a month. 3.2.4 Developers used for enzyme reaction: take choline oxidase of enzyme activity 100 to 200, peroxidase of enzyme activity 250 to 280, phospholipase D of enzyme activity 75 to 100, 15 mg 4-aminoantipyrine, 50 mg phenosalyl and put them into a volumetric flask, then dilute to the scale with 0.05 mol/L Tris buffer solution. Prepare it at instant use. 3.2.5 Sodium hydroxide solution (500g/L): dissolve 500g sodium hydroxide into water and dilute to 1000 mL. 3.3 Standard Choline Bitartrate standard (C9H19NO7): purity≥99%. 3.4 Preparation of standard solution 3.4.1 Choline hydroxide standard stock solution (2.5 mg/mL): Bake choline bitartrate to constant weight at 102 ℃ ± 2℃ and dissolve 523 mg in a 100mL volumetric flask, and then dilute to the scale with distilled water. Store it in 4℃ ± 2 ℃ refrigerator and preserve it for no more than one week. 3.4.2 Choline hydroxide standard working solution (250 μg/mL): take 10.0 mL standard stock solution and transfer to a 100mL volumetric flask, and then dilute with water to the scale. Prepare at instant use. 4 Apparatus 4.1 Balance: the sensibility is 0.01g and 0.1mg. 4.2 Constant temperature water bath kettle: the temperature may be controlled at 70℃ ± 2℃ and 37℃ ± 2℃. 4.3 PH meter: with a precision of 0.01. 4.4 Spectrophotometer. 5 Analytical Procedures 5.1 Sample preparation 5.1.1 Solid sample Weigh 5 g (to the accuracy of 0.01 g) well-mixed sample in a 100mL conical flask, and add 30 mL hydrochloric acid solution (3.2.1). 5.1.2 Liquor sample Weigh 20 g (to the accuracy of 0.01 g) well-mixed sample in a 100mL conical flask, and add 10 mL hydrochloric acid solution (3.2.2). 5.1.3 Hydrolization Place the vessel filled with sample into 70℃ water bath, cover it and mix uniformly. Hydrolyzing for 3 h (shake it at intervals of 30 min), cool down. Calibrate the pH value as 3.5 to 4.0 with sodium hydroxide solution, and then transfer to a 50mL volumetric flask and dilute to the scale with distilled water. 5.1.4 Filtration Filter hydrolysate (5.1.3). The filtered solution shall be clear, otherwise re-filter with a 0.45 μm filter membrane. Filtered solution may be stored 3 d in refrigerator at 4℃. 5.2 Determination 5.2.1 Standard curve making Take respectively 2 mL, 4 mL, 6 mL and 8 mL choline hydroxide standard working solution in 10mL volumetric flasks, then dilute to the scale with distilled water. Prepare 6 cuvettes, one foe reagent blank (A), the rest numbered respectively as 1 to 5 and used for standard solution and four dilution of standard solution. Put in reagents according to those specified in Table 1.

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準 GB 5413.20—2013 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定 2013-11-29 發布 2014-06-01 實施 前 言 本標準代替GB/T 5413.20—1997《嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測定》。 本標準與GB/T 5413.20—1997相比，主要變化如下： ——修改了標準的名稱； ——修改了用于酶反應的顯色劑成分； ——增加了第二法雷氏鹽分光光度法。 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定 1 范圍 本標準規定了嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定方法。 本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定。 第一法 酶比色法 2 原理 試樣中的膽堿經酸水解后變成游離態的膽堿，再經酶氧化后與顯色劑反應生成有色物質，其顏色 的深淺在一定濃度范圍內與膽堿含量成正比。 3 試劑和材料 注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T6682 規定的三級水。 3.1 試劑 3.1.1 三羥甲基氨基甲烷[(CH2OH)3CNH2]。 3.1.2 苯酚(C6H5OH)。 3.1.3 濃鹽酸 (HCl)。 3.1.4 氫氧化鈉(NaOH)。 3.1.5 膽堿氧化酶：置于-20 ℃保存。 3.1.6 過氧化物酶：置于 2 ℃~8 ℃保存。 3.1.7 4-氨基安替比林(C11H13N3O) 。 3.1.8 磷脂酶 D：置于-20 ℃保存。 3.2 試劑配制 3.2.1 鹽酸(1 mol/L)：量取 85 mL 濃鹽酸加水稀釋至 1000 mL。 3.2.2 鹽酸(3 mol/L)：量取 125 mL 濃鹽酸加水稀釋至 500 mL。 3.2.3 Tris 緩沖溶液（0.05 mol/L）：pH =8.0±0.2。 稱取6.057 g三羥甲基氨基甲烷溶入500 mL蒸餾水中，用1 mol/L鹽酸調pH至8.0±0.2，用蒸餾水定 容至1000 mL。此溶液在4℃冰箱中可保存一個月。 3.2.4 用于酶反應的顯色劑：取 100 ~120 活力單位的膽堿氧化酶、250~280 活力單位的過氧化物酶、 75 個~100 個活力單位的磷脂酶 D、15 mg 4-氨基安替比林，50 mg 苯酚置于 100 mL 的容量瓶中，用 0.05 mol/L Tris 緩沖溶液稀釋至刻度。臨用時配制。 3.2.5 氫氧化鈉溶液(500 g/L)：稱取 500 g 氫氧化鈉，溶于水并稀釋至 1000 mL。 3.3 標準品 膽堿酒石酸氫鹽標準品（C9H19NO7）：純度≥99%。 3.4 標準溶液配制 3.4.1 膽堿氫氧化物標準貯備溶液（2.5 mg/mL）：稱取在 102℃±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽 523 mg 置于 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。冷藏于 4℃±2℃冰箱中，保存不超過 1 周。 3.4.2 膽堿氫氧化物標準工作溶液（250 μg/mL）：吸取 10.0 mL 標準貯備溶液于 100 mL 容量瓶中， 用水稀釋至刻度。臨用時配制。 4 儀器和設備 4.1 天平：感量為 0.01 g 和 0.1 mg。 4.2 恒溫水浴鍋：溫度可控制在 70℃±2℃和 37℃±2℃。 4.3 pH 計：精度 0.01。 4.4 分光光度計。 5 分析步驟 5.1 試樣制備 5.1.1 固體試樣 稱取 5 g（精確到 0.01 g）混合均勻的試樣，于 100 mL 的錐形瓶中，加入 30 mL 鹽酸溶液（3.2.1）。 5.1.2 液體試樣 稱取 20 g（精確到 0.01 g）混合均勻的試樣，于 100 mL 的錐形瓶中，加入 10 mL 鹽酸溶液（3.2.2）。 5.1.3 水解 將裝有試樣的容器放在 70℃水浴中，加塞混勻，水解 3 h（每隔 30 min 振搖一次），冷卻。用氫 氧化鈉溶液調 pH 為 3.5～4.0，轉入 50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。 5.1.4 過濾 過濾水解液（5.1.3）。濾液應是澄清的，否則，用 0.45 μm 的濾膜再次過濾。濾液放在 4℃的冰箱 中可以保存 3 d。 5.2 測定 5.2.1 標準曲線的制作 分別吸取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL膽堿氫氧化物標準工作溶液于10 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀 釋至刻度。準備6支試管，一個試管用作試劑空白（A），另五支試管由1至5編號，分別用于標準溶液 和標準溶液的四個稀釋度。按表1加入試劑。 表1 制作標準曲線時的試劑添加量 單位為毫升 試劑 管A 管1 管2 管3 管4 管5 稀釋度1/（50μg/mL） — 0.100 — — — — 稀釋度2/（100μg/mL） — — 0.100 — — — 稀釋度3/（150μg/mL） — — — 0.100 — — 稀釋度4/（200μg/mL） — — — — 0.100 — 標準溶液/（250μg/mL） — — — — — 0.100 蒸餾水 0.100 — — — — — 發色劑 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 用密封保護膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反應15 min。 5.2.2 試樣的測定 將每個試樣準備 2 支試管（B，C），按表 2 加入試劑。 表 2 測定試樣時的試劑添加量 單位為毫升 試劑 試管B 濾液空白 試管C 試樣 待分析濾液 0.100 0.100 蒸餾水 3.00 — 發色劑 — 3.00 用密封保護膜蓋住試管，混勻。把試管置于 37℃水浴中保溫反應 15 min。 5.2.3 比色測定 將試樣及標準系列溶液從水浴中取出，冷卻至室溫。在波長 505 nm 處，用蒸餾水作空白，測定 吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標，制 作標準曲線。 6 分析結果的表述 6.1 凈吸光值的計算 通常新鮮配制的試劑會產生輕微顏色，且由于水解作用濾液也不是無色的，為了除去這些干擾因素， 應該從總吸光值中減去各自的空白值（管A和管B）。 試樣凈吸光值計算如公式（1）所示： A ? Atot ? Abl ? Aex …………………………………………………………………（1） 式中： A ——試樣凈吸光值； Atot——總吸光值（管C）； Abl ——試劑吸光值（管A）； Aex——濾液吸光值（管B）。 Abl和Aex不應大于總吸光值的20%，對于標準曲線，Aex= 0。 6.2 膽堿含量的計算 在標準曲線上查出凈吸光值的位置，并記下相應的濃度c，以每100 g試樣中膽堿氫氧化物的毫克 數表示膽堿的含量（X），單位為（mg/100 g），試樣中的膽堿氫氧化物含量按公式（2）計算： 式中： X ? c ? V ?100 m ?1000 …………………………………（2） X——試樣中的膽堿氫氧化物含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）； c——自標準曲線上查得的膽堿氫氧化物的濃度，微克每毫升（μg/mL）； V——水解液被稀釋的體積（通常為50 mL），單位為毫升（mL）； m ——試樣的質量，單位為克（g）； 1000——換算系數。 計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留整數位。 7 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的 8%。 8 其他 方法檢出限為 1 mg/100g，定量限為 3 mg/100g。 第二法 雷氏鹽分光光度法 9 原理 試樣中的膽堿用氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷混合溶液水解抽提，經弗羅里硅土層析凈化，與雷納克 銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，用丙酮溶解洗脫，于 526 nm 測定吸收值。在一定濃度范圍 內，膽堿雷納克銨鹽顏色的深淺與其含量成正比。 10 試劑和材料 注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規定的三級水。 10.1 試劑 10.1.1 弗羅里硅土：100 目～200 目，650℃活化。 10.1.2 甲醇（CH3OH）。 10.1.3 三氯甲烷（CHCl3）。 10.1.4 氫氧化鋇[Ba（OH）2·8H2O]。 10.1.5 冰乙酸（CH3COOH）。 10.1.6 乙酸甲酯（C3H6O2）。 10.1.7 丙酮(CH3COCH3)。 10.1.8 雷納克銨鹽(C4H10CrN7S4)。 10.2 試劑配制 10.2.1 飽和氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷溶液：稱取 6 g 氫氧化鋇溶于 100 mL 甲醇中， 放入超聲波中 溶解后，加入 10 mL 三氯甲烷，混勻。 10.2.2 冰乙酸-甲醇溶液(1+10)：1 體積冰乙酸與 10 體積甲醇混合。 10.2.3 雷納克銨鹽溶液：稱取 0.25 g 雷納克銨鹽，加入 10 mL 水中，放入超聲波中溶解后過濾，臨 用時配制。 10.3 標準品 膽堿酒石酸氫鹽(C9H19NO7)：純度≥99%。 10.4 標準溶液配制 膽堿酒石酸氫鹽標準溶液(1 g/L)：準確稱取在 102℃±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽 0.1000 g， 用蒸餾水定容至 100 mL 容量瓶中。冷藏于 4℃±2℃冰箱中，保存不超過一周。 11 儀器和設備 11.1 天平：感量為 0.01 g 和 0.1 mg。 11.2 回流裝置：250 mL 磨口錐形瓶及回流裝置。 11.3 恒溫水浴鍋：溫度可控制在 79℃±2℃。 11.4 層析柱：長約 10 cm、內徑 1 cm 的帶 50 mL 杯口的玻璃柱。 11.5 分光光度計。 12 分析步驟 12.1 試樣制備 稱取固體試樣 10 g(精確到 0.01 g)，稱取液體試樣 20 g(精確到 0.01 g)于磨口錐形瓶中，加入 50 mL 氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷提取液。混合均勻后接入回流裝置，于 79±2℃的水浴鍋內水解抽提 4 h。每 隔 1 h 震蕩一次，以避免試樣結塊。水解抽提結束后，取出錐形瓶冷卻至室溫，過濾。濾渣用冰乙酸- 甲醇混合液洗滌 3 次～4 次，洗液一并收集于 100 mL 容量瓶中。用甲醇定容至刻度，混勻。 12.2 標準曲線的繪制 12.2.1 層析柱制備 用乳膠管連接層析柱與滴頭，用少量脫脂棉堵住層析柱底部，倒入約 5 cm 左右高的弗羅里硅土， 用甲醇浸濕，備用。 12.2.2 層析 分別吸取膽堿標準溶液 0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 注入層析柱中，當溶液 完全進入柱床后，依次用 5 mL 和 10 mL 甲醇，20 mL 乙酸甲酯洗滌層析柱。再加入 5 mL 雷納克銨鹽 溶液，用適量的冰乙酸洗去過量的雷納克銨鹽，直至層析柱上無雷納克銨鹽附著處呈現硅土原有的白 色。用丙酮洗脫粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，收集于 10 mL 的容量瓶中，用丙酮定容（如果洗脫液混濁 需過 0.45 μm 的濾膜）。在波長 526 nm 處測定溶液的吸光值，以膽堿酒石酸氫鹽含量為橫坐標（mx）， 吸光值為縱坐標繪制標準曲線。 12.3 試樣的測定 吸取10 mL試樣水解液（12.1）于層析柱中，其余操作按照 12.2.2進行。自標準曲線上查得10 mL 試樣水解液中膽堿酒石酸氫鹽的含量。 13 分析結果的表述 試樣中的膽堿以膽堿氫氧化物計，以毫克每百克（mg/100g）表示，按公式（3）計算： X ? mx ?100 ? 0.474 …………………………………（3） m ? V 100 式中： X——試樣中膽堿氫氧化物的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）； m——試樣的質量，單位為克（g）； V——層析時吸取試樣水解液的體積，單位為毫升（mL）； mx——從標準曲線上查得膽堿酒石酸氫鹽的含量，單位為毫克（mg）； 0.474——膽堿酒石酸氫鹽轉化為膽堿氫氧化物的系數。 計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留整數位。 14 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的 10%。 15 其他 方法檢出限為 2 mg/100g，定量限為 5 mg/100g。