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This document was proposed by the National Medical Products Administration of People's Republic of China.
This document is under the jurisdiction of the National Technical Committee on Biological Evaluation on Medical Device of Standardization Administration of China (SAC/TC 248).
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Introduction
The normal keratinocytes obtained from healthy volunteers may be cultured at the gas-liquid interface on the film or filter paper for several days to form a three-dimensional skin model, including the basal layer, stratum spinosum, granular layer and functional stratum corneum, that is, the reconstructed human epidermis model. This model was originally developed to detect outer skin irritation of pure chemical objects. In recent years, such models have also been used to detect stimulating substance in medical devices.
In vitro skin irritation test for medical devices
1 Scope
This document specifies a method for test for medical devices using a reconstructed human epidermis (RhE) model.
This document is applicable to in vitro skin irritation test using RhE model to evaluate the potential skin irritation of medical devices.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
GB/T 16886.10 Biological evaluation of medical devices — Part 10: Tests for irritation and skin sensitization
GB/T 16886.12 Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference materials
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in GB/T 16886.10 and GB/T 16886.12 apply.
4 Test principle
The polar and non-polar extracts of medical devices/materials or the devices/materials themselves may directly contact the upper surface of the RhE model; wash and remove the test samples on the epidermis after incubation for a certain time, and then detect the cell activity of the RhE model by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) test; compare with the negative control to obtain the tissue activity, and predict the irritation of the test samples according to the tissue activity.
5 Material
5.1 RhE model
The commercial RhE model is used for the test. See Annex A for instructions of RhE model.
Epidermal cells shall be taken from healthy volunteers whose antigens are negative for human immunodeficiency virus (HIV) 1 and 2 antibodies, HCV-Ab, hepatitis B. Users of this document should establish corresponding safety and health regulations to ensure biosafety.
5.2 Instruments and apparatus
Instruments and apparatus are as follows:
a) bechtop;
b) biosafety cabinet;
c) cell incubator;
d) balance;
e) microplate reader;
f) horizontal shaking table;
g) vortex oscillator;
h) pipettor (200 μL, 1 mL), piston displacement pipettor (100 μL), continuous liquid separator;
i) timer.
5.3 Reagent consumables
Reagent consumables are as follows:
a) skin model culture medium (provided by the skin model manufacturer and used together with the skin model);
b) Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, 1 ×);
c) sodium chloride injection (mass concentration: 0.9%);
d) sesame oil (high purity or medicinal grade);
e) MTT;
f) sodium dodecyl sulfate (SDS, mass concentration: 20%);
g) isopropanol (analytically pure);
h) 6-well culture plate, 24-well culture plate and 96-well culture plate (flat bottom).
i) aseptic centrifuge tube;
j) flushing liquid collection bottle;
k) angled blunt nose tweezers;
l) large funnel;
m) sealing film;
n) tin foil;
o) sterile cotton swab.
6 Test procedure
6.1 Preparation of extract and control solution
6.1.1 Preparation of extract
The extracts of medical devices and/or materials shall be prepared according to GB/T 16886.12, and attention shall be paid to aseptic operation.
0.9% sodium chloride injection should be used as polar extraction vehicle to prepare polar extraction solution, and sesame oil should be used as non-polar extraction vehicle to prepare non-polar extraction solution. If other extraction vehicle is used, it shall be proved that the extraction vehicle will not affect the test system.
The extraction time and temperature should be demonstrated based on GB/T 16886.12.
When testing medical devices and/or materials that are not suitable for extraction, their suitability should be demonstrated.
6.1.2 Preparation of control solution
6.1.2.1 Negative control
Sterile DPBS (1 ×).
6.1.2.2 Vehicle control
The vehicle control shall be placed in the extraction container, and the same extraction procedure as the medical device and/or material shall be carried out.
6.1.2.3 Positive control
1% SDS solution. Take 0.5 mL of 20% SDS aqueous solution and 9.5 mL of corresponding extraction vehicle, and mix well with vortex oscillator.
Note 1: The positive control prepared freshly on the day of test is used, and it is recommended to use 20% commercial SDS solution to prepare positive control. SDS positive control may be prepared by sterile DPBS when the test samples are not suitable for extraction.
Note 2: If the test sample reacts with MTT reagent, or the tissues or cells are stained; and there is still a certain amount of residue after washing, the test results may be disturbed.
In this case, an appropriate control may be set to eliminate interference.
Foreword i
Introduction ii
1 Scope
2 Normative references
3 Terms and definitions
4 Test principle
5 Material
6 Test procedure
7 Data calculation steps
8 Acceptance criteria for test
9 Result judgment
10 Test report
Annex A (Informative) Description of the RhE model
Bibliography
ICS 11.040.01
CCS C 30
YY
中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
YY／T 1808—2021
醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗
In vitro skin irritation test for medical devices
2021-09-06發(fā)布 2022-09-01實施
國家藥品監(jiān)督管理局 發(fā)布
前言
本文件按照GB／T 1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。
本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。
本文件由全國醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC／TC 248)歸口。
引言
將從健康志愿者獲取的正常角蛋白細(xì)胞在薄膜或濾紙上的氣液交界面培養(yǎng)數(shù)日后可形成包括基底層、棘層、顆粒層和有功能的角質(zhì)層在內(nèi)的三維皮膚模型，即重建人表皮模型。此模型起初是為檢測純化學(xué)物體外皮膚刺激性而研發(fā)的。近年來，此類模型也被用于檢測醫(yī)療器械中的刺激性物質(zhì)。
醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗
1 范圍
本文件規(guī)定了采用重建人表皮(RhE)模型進(jìn)行醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗的方法。
本文件適用于采用RhE模型進(jìn)行體外皮膚刺激試驗評價醫(yī)療器械潛在的皮膚刺激性。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GB／T 16886.10 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第10部分：刺激與皮膚致敏試驗
GB／T 16886.12 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第12部分：樣品制備與參照材料
3 術(shù)語和定義
GB／T 16886.10和GB／T 16886.12界定的術(shù)語和定義適用于本文件。
4 試驗原理
醫(yī)療器械／材料的極性和非極性浸提液或器械／材料本身可直接接觸RhE模型的上表面，孵育一定.時間后沖洗除去表皮上的試驗樣品，再用四甲基偶氮唑鹽(MTT)試驗檢測RhE模型細(xì)胞活性，與陰性對照相比得到組織活度，根據(jù)組織活度預(yù)測試驗樣品的刺激性。
5 材料
5.1 RhE 模型
使用商品化RhE模型進(jìn)行試驗。RhE模型的說明見附錄A。
表皮細(xì)胞應(yīng)取自人類免疫缺陷病毒(HIV)1、2抗體、丙型肝炎抗體、乙肝等抗原均陰性的健康志愿者。本文件的使用者宜建立相應(yīng)的安全和健康規(guī)程以確保生物安全。
5.2 儀器設(shè)備
儀器設(shè)備如下：
a) 超凈工作臺。
b) 生物安全柜。
c) 細(xì)胞培養(yǎng)箱。
d) 天平。
e) 酶標(biāo)儀。
f) 水平搖床。
g) 渦旋振蕩器。
h) 移液器(200μL、1mL)、活塞排代式移液器(100μL)、連續(xù)分液器。
i) 計時器。
5.3 試劑耗材
試劑耗材如下：
a) 皮膚模型培養(yǎng)基(由皮膚模型制造商提供，與皮膚模型配套使用)。
b) 杜氏磷酸緩沖鹽溶液(DPBS，1×)。
c) 氯化鈉注射液(質(zhì)量濃度：0.9％)。
d) 芝麻油(高純度或藥用級)。
e) MTT。
f) 十二烷基硫酸鈉(SDS，質(zhì)量濃度：20％)。
g) 異丙醇(分析純)。
h) 6孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板(平底)。
i) 無菌離心管。
j) 沖洗液收集瓶。
k) 彎頭鈍頭鑷子。
l) 大漏斗。
m) 封口膜。
n) 錫箔紙。
o) 無菌棉棒。
6 試驗步驟
6.1 浸提液及對照液的制備
6.1.1 浸提液的制備
應(yīng)按照GB／T 16886.12制備醫(yī)療器械和／或材料浸提液，注意無菌操作。
宜使用0.9％氯化鈉注射液作為極性浸提介質(zhì)制備極性浸提液，宜使用芝麻油作為非極性浸提介質(zhì)制備非極性浸提液。若使用其他浸提介質(zhì)，應(yīng)證明浸提介質(zhì)不影響試驗系統(tǒng)。
宜基于GB／T 16886.12論證浸提時間和溫度。
不適合浸提的醫(yī)療器械和／或材料進(jìn)行試驗時，宜論證其適用性。
6.1.2 對照液的制備
6.1.2.1 陰性對照
無菌DPBS(1×)。
6.1.2.2 介質(zhì)對照
應(yīng)將介質(zhì)對照置于浸提容器中并進(jìn)行與醫(yī)療器械和／或材料相同的浸提程序。
6.1.2.3 陽性對照
1％的SDS溶液。取0.5mL 20％SDS水溶液與9.5mL相應(yīng)浸提介質(zhì)，用漩渦振蕩器充分混勻。
注1：使用試驗當(dāng)天新鮮制備的陽性對照，推薦使用商品化20％SDS溶液制備陽性對照。對不適合浸提的試驗樣品進(jìn)行試驗時，可用無菌DPBS制備SDS陽性對照。
注2：若試驗樣品與MTT試劑反應(yīng)，或?qū)⒔M織或細(xì)胞染色且在沖洗后仍有一定量的殘留，試驗結(jié)果可能會被干擾。
在這種情況下，可設(shè)置適宜的對照以消除干擾。
6.2 RhE 模型的準(zhǔn)備及預(yù)孵育
接收皮膚組織后，根據(jù)模型制造商的說明將模型放入大小合適的培養(yǎng)板(如6孔培養(yǎng)板)中，用配套的培養(yǎng)基預(yù)孵育。根據(jù)制造商的說明將適量培養(yǎng)基加入培養(yǎng)板中。無菌條件下，打開盛有RhE模型的培養(yǎng)板蓋子。用鑷子小心拿出盛有皮膚組織的小室，在無菌紗布或濾紙上輕輕除去粘附在小室外側(cè)緣的殘留瓊脂。檢查確認(rèn)無殘留后將模型轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，傾斜小室避免底部產(chǎn)生氣泡。根據(jù)制造商說明書預(yù)孵育皮膚模型。
注：保存運(yùn)送組織的瓊脂培養(yǎng)板室溫下密封數(shù)日能觀察有無污染跡象。
6.3 加樣和沖洗
6.3.1 總則
雖然采用不同模型進(jìn)行的體外皮膚刺激試驗都遵循相同原則，但不同模型的具體操作可能存在差異。接觸時間等條件宜遵從制造商說明書的規(guī)定。
6.3.2 準(zhǔn)備
室溫預(yù)熱培養(yǎng)基。加樣前約5min從培養(yǎng)箱中拿出預(yù)孵育的培養(yǎng)板。加樣前準(zhǔn)備大小合適的培養(yǎng)板(根據(jù)制造商的要求選擇)用于RhE模型與樣品及對照的孵育。用代碼標(biāo)記培養(yǎng)板蓋子，每個試驗樣品(如樣品1的兩種浸提液可記為T1-1和T1-2)、陽性對照(可記為PC1和PC2)、介質(zhì)對照(可記為VC1和VC2)和陰性對照(可記為NC)分別使用3塊組織。更換小室下的培養(yǎng)基或?qū)⑿∈乙迫牒迈r培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中。檢查培養(yǎng)板底部以確認(rèn)轉(zhuǎn)移過程中無氣泡產(chǎn)生。
6.3.3 加樣
分別吸取100μL未稀釋的試驗樣品、VC、NC或PC置于每個表皮表面(平行3孔，注意使用活塞排代式移液器吸取黏稠液體)。用槍頭輕輕將液體鋪在皮膚上表面。加樣完成后，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板至培養(yǎng)箱(37℃±1℃，5％CO2±1％CO2，相對濕度95％)孵育至制造商規(guī)定時間。
注1：記住加樣順序，因沖洗順序要與加樣順序一致。
注2：因模型表面是疏水的，所以要確保100μL溶液均勻涂布在表皮的整個表面。在表面張力作用下，有時極性溶劑微滴只能分布到表皮的外緣。這種情況下，可使用槍頭鋪開樣品或使用鑷子敲擊小室使樣品覆蓋整個表皮。另外，對于油性浸提液或1％ SDS芝麻油乳濁液，可使用頭端球狀的玻璃器具或移液器吸頭鋪開液體以保證其與整個表皮完全接觸。
6.3.4 沖洗
孵育后，使用連續(xù)分液器吸取滅菌DPBS徹底沖洗組織，推薦沖洗15～25次以去除殘留試驗材料，根據(jù)組織制造商提供的具體說明進(jìn)行。沖洗不能太輕柔，否則試驗樣品不能完全清除，可使用大漏斗和塑料瓶收集沖洗液，注意防止飛濺和污染。沖洗后，在無菌吸水紙上反扣小室排干水分。使用棉簽輕輕拭干表皮表面，并用吸水紙或棉簽拭干小室底部。轉(zhuǎn)移小室至預(yù)先加有新鮮培養(yǎng)基(0.3mL／孔)的24孔板中臨時存儲，準(zhǔn)備進(jìn)行MTT孵育。若發(fā)現(xiàn)皮膚表面仍有殘存試驗樣品，使用無菌棉棒去除并記錄。
6.4 RhE模型MTT孵育及吸光度測定
6.4.1 MTT孵育
6.4.1.1 MTT母液配制
將MTT粉末溶解于DPBS中，質(zhì)量濃度為5mg／mL。MTT充分溶解后，使用0.22μm濾膜過濾，用錫箔紙包裹避光－20℃保存，可保存1年。
6.4.1.2 MTT工作液配制
用室溫預(yù)熱的培養(yǎng)基將MTT母液稀釋至1mg／mL。
注：MTT工作液要現(xiàn)配現(xiàn)用。
6.4.1.3 轉(zhuǎn)移及孵育
從臨時存儲板中移出小室，使用無菌吸水紙或無菌棉簽拭干小室底部，然后將其轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入0.3mL MTT工作液的24孔板中，使用錫箔紙包裹避光。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱(37℃±1℃，5％CO2±1％CO2，相對濕度95％)孵育180min±5min。
6.4.1.4 萃取
MTT孵育完成后，拭干小室內(nèi)外所有殘留MTT溶液，根據(jù)組織制造商說明轉(zhuǎn)移組織至合適的盛有適量異丙醇的組織培養(yǎng)板中。使用封口膜密封容器或培養(yǎng)板防止液體揮發(fā)。記錄開始時間，用培養(yǎng)板振蕩器(120r／min)室溫振蕩至少120min±5min。使用槍頭或注射針刺破組織得到相應(yīng)孔中的萃取液。用加樣器至少混勻3次至溶液均勻后轉(zhuǎn)移至96孔板。
注：上述密封平板在不振蕩條件下可在室溫或冰箱內(nèi)避光過夜萃取(18 h~24 h).收集萃取液前使用振蕩器振蕩平板至少15min。
6.4.2 吸光度測定
根據(jù)模型制造商說明從每個試驗孔中轉(zhuǎn)移200μL液體至平底96孔培養(yǎng)板中(適當(dāng)標(biāo)記)，平行3孔。使用酶標(biāo)儀根據(jù)制造商說明在合適的波長下測定吸光度(OD)值，通常使用570nm波長。異丙醇溶液作為空白對照，平行6孔。
注：及時測量，避免96孔板中異丙醇蒸發(fā)。
7 數(shù)據(jù)計算步驟
以下計算步驟適用于不與MTT試劑反應(yīng)、無色、不會將組織染色、非特異性O(shè)D值小于或等于陰性對照的5％的試驗樣品。
a) 空白對照：計算6個空白對照孔的平均OD值作為空白對照組OD值。
b) NC：NC組每塊組織3個復(fù)孔的OD值均減去空白對照OD值后再相加求和，其和除以3得NC組每塊組織的OD值，然后計算NC組3塊組織OD值的平均值作為NC組OD值。
c) PC： 同法計算PC組每塊組織的OD值。用下式計算PC組每塊組織的組織活度：
式中：
VD——組織活度，％；
ODx——PC、VC或試驗樣品組每塊組織的OD值；
ODNC——NC組OD值。
然后計算PC組3塊組織的組織活度的平均值作為PC組的組織活度。
d) 同法計算試驗樣品和VC組每塊組織的組織活度，然后計算各組3塊組織平均組織活度作為各組的組織活度。
e) 根據(jù)各組每塊組織的組織活度計算各組3塊組織的組織活度的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。
注：若為排除試驗樣品干擾設(shè)置了相應(yīng)對照，則在計算結(jié)果時扣除非特異性O(shè)D值。
8 試驗接受準(zhǔn)則
8.1 NC和VC接受準(zhǔn)則
a) NC或VC的3塊組織OD570平均值大于或等于0.7且小于3.0，則NC或VC的組織活度通常符合接受準(zhǔn)則。
注：0.7和3.0是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織化學(xué)品試驗導(dǎo)則439(OECD TG439)中幾種RhE模型NC和VC的最小和最大OD值，每種模型組織的范圍可能有所差異。
b) 除了符合a)外，每種模型NC和VC的OD值范圍應(yīng)符合制造商各自的接受準(zhǔn)則。
c) 孵育后NC或VC3塊組織的組織活度的SD小于或等于20％。
d) VC組的組織活度應(yīng)為NC的80％～120％。
8.2 PC接受準(zhǔn)則
孵育后PC組的組織活度為NC的40％以下且3塊組織的組織活度的SD小于或等于20％，則PC數(shù)據(jù)符合接受準(zhǔn)則。
8.3 試驗樣品數(shù)據(jù)接受準(zhǔn)則
試驗樣品孵育后3塊組織的組織活度的SD小于或等于20％，則認(rèn)為數(shù)據(jù)有效。若不符合要求則應(yīng)重復(fù)試驗。
9 結(jié)果判定
根據(jù)試驗樣品組的組織活度預(yù)測試驗樣品潛在刺激性。組織活度小于或等于陰性對照的50％即表示出現(xiàn)刺激反應(yīng)。試驗組至少一個浸提液組的組織活度小于或等于50％，則認(rèn)為此醫(yī)療器械／材料有皮膚刺激性，見表1。
表1 皮膚刺激結(jié)果的判定
試驗結(jié)果 判定
至少一個浸提液組的組織活度小于或等于陰性對照的50％ 刺激性(I)
兩個浸提液組的組織活度均大于陰性對照的50％ 非刺激性(NI)
10 試驗報告
試驗報告應(yīng)至少包括以下信息：
——試驗材料或器械的描述；
——RhE模型的描述及其質(zhì)控證書復(fù)印件；
——試驗方法，包括樣品制備過程的詳細(xì)描述；
——試驗結(jié)果；
——試驗結(jié)論。
附錄A
(資料性)
RhE模型的說明
OECD TG 439中收錄了已經(jīng)經(jīng)過驗證的6種RhE模型：EpiSkinTM (SM)、EpiDermTM SIT(EPI-200)、SkinEthicTM RHE、LabCyte EPI-MODEL24 SIT、epiCS和Skin＋。另外，文件中還提供了模型驗證方案與接受準(zhǔn)則。其他模型若能通過對6種RhE模型比對試驗相同的刺激及非刺激材料進(jìn)行的實驗室間(至少3個實驗室)3輪(3個生產(chǎn)批號的RhE模型)盲法驗證試驗，證明其預(yù)測能力、實驗室內(nèi)及實驗室間變異性與已收錄某種模型有等同的表現(xiàn)，則可證明其與已收錄模型的等效性。
ISO／TC 194相關(guān)工作組采用以上6種模型中的EpiDermTM (EPI-200)和SkinEthicTM RHE兩種模型對醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗進(jìn)行了國際實驗室間比對，驗證了這兩種模型的有效性。
其他模型如果通過了以上兩種形式的比對試驗即追隨驗證試驗(catch-up validation)，則認(rèn)為可用于醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗。
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